恩诺沙星是一种人工合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，主要用于治疗动物的呼吸道、泌尿道、胃肠道等感染疾病。然而，恩诺沙星残留问题不容忽视。恩诺沙星残留可能对人体健康造成多种危害。首先，它可能透过血脑屏障，对中枢神经系统产生刺激，引发头晕、头痛、失眠、烦躁不安等症状，严重时甚至可能导致抽搐、惊厥等神经系统异常反应。其次，恩诺沙星主要通过肝脏代谢和肾脏排泄，长期或大量摄入可能加重肝肾负担，导致肝肾功能损害，表现为转氨酶升高、肾功能指标异常等。此外，恩诺沙星还可能影响软骨的正常发育，对未成年人的骨骼生长造成不良影响。同时，它还可能引发胃肠道反应，如恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状。鉴于恩诺沙星残留的危害性，社会各界对恩诺沙星残留问题给予了高度关注。政府、科研机构、企业和消费者都在积极寻求解决方案，以减少恩诺沙星残留带来的风险。各国政府都对其在食品中的残留量进行了严格的管控。例如，在中国，恩诺沙星的国家标准主要规定在《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》(GB 31650-2019)中。该标准详细规定了恩诺沙星在不同食品中的最大残留限量，如在淡水鱼类中的最大限定限量为100μg/kg。为了确保食品中恩诺沙星残留量不超过限量标准，政府部门还加强了对养殖、屠宰、加工、销售等环节的监管力度，并定期对市场上的食品进行抽检。恩诺沙星作为一种广谱抗菌药物，在水产养殖中广泛应用。尽管有严格的国家管控措施，恩诺沙星残留超标的现象仍然时有发生。这主要是由于一些养殖户为了追求快速治疗效果，违规加大用药量，或者不遵守休药期规定，导致药物在动物体内残留量超标。除了加强国家管控外，还需要提高养殖户的法律意识和责任意识，确保他们严格按照规定使用药物。

目前，市面上常用的恩诺沙星检测技术主要包括高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）、荧光分析法以及生物传感器法等。其中，HPLC凭借强大的分离能力与高精度，能精准分离并定量恩诺沙星，检测结果准确可靠，可满足严格食品安全标准，但该方法设备昂贵、操作复杂，对人员专业度要求高，且检测耗时较长，难以实现大规模快速筛查；ELISA操作简便、快速，适合大规模样本的初步筛选，灵敏度也较高，能检测出低含量残留，不过它基于抗原抗体反应，易受非特异性因素干扰，出现假阳性结果，影响检测准确性；荧光分析法灵敏度高，可检测微量恩诺沙星残留，且能通过不同荧光特性实现多组分同时检测，但荧光试剂稳定性差，易受环境因素影响，导致荧光信号波动，影响检测稳定性，同时仪器成本也较高；生物传感器法响应速度快、灵敏度高、选择性好，能实时监测恩诺沙星残留，且可小型化、便携化，便于现场检测，但目前生物传感器稳定性与重复性有待提高，使用寿命相对较短，还需进一步优化完善。因此，以上技术各有优缺点，为了实现对恩诺沙星残留的快速、准确以及可视化检测，需要不断研发新的检测技术，提高检测的灵敏度和准确性，降低检测成本，简化操作流程，以满足实际检测需求。

核酸适配体（Aptamer）是一段通过体外筛选技术（如SELEX技术）从随机寡核苷酸文库中获得的单链DNA或RNA序列。它们能够高特异性、高亲和力地与各种靶标分子（如蛋白质、小分子、细胞等）结合，类似于抗体，但具有合成简单、稳定性好、易于修饰等优点。现如今，核酸适配体技术已广泛应用于病原检测和药物残留检测等领域，通过研读其在其他领域的应用，可以更好地为本研究提供参考。核酸适配体在病原体检测领域成果显著。针对新冠病毒、HIV、流感病毒、稻瘟病菌、疟原虫等不同病原体，筛选出特异性适配体，结合侧向流免疫层析、电化学检测、磁珠分离PCR、荧光检测等技术，能在短时间内完成检测，操作简便、灵敏度高，为疾病早期诊断和防控提供有力支持。核酸适配体用于抗生素和激素残留检测，保障食品安全。针对四环素类抗生素、克伦特罗（瘦肉精）等，筛选适配体结合金纳米粒子、石英晶体微天平传感器等，通过颜色变化、频率变化等实现快速检测和定量分析，适用于多种食品检测，检测限低。核酸适配体在兽药和农药残留检测中作用突出，保障农产品质量。针对磺胺类兽药、有机磷类及拟除虫菊酯类农药，筛选适配体结合纳米材料、电极等，构建荧光或电化学检测体系，可在短时间内完成检测，灵敏度高，便于现场检测。

针对当前临床检测方法存在的局限性，本研究提出了一种创新的纳米金-核酸适配体可视化检测技术。该技术利用核酸适配体对恩诺沙星的高特异性结合能力，结合纳米金的信号放大效应，实现了对恩诺沙星残留的高灵敏度、高特异性快速检测。相比传统的高效液相色谱法（HPLC）和酶联免疫吸附法（ELISA）等方法，该方法具有操作简便、成本低廉、环保性好等优势。本研究不仅为恩诺沙星残留检测提供了一种新的高效工具，也为保障食品安全和人类健康提供了有力支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂：四氯金酸、柠檬酸钠、氯化钠、恩诺沙星等，实验用水为二级蒸馏水。

1.1.2 实验鱼：鲤鱼

1.2 实验方法

1.2.1 金纳米粒子的制备

采用柠檬酸盐还原法合成金纳米粒子（AuNPs)。100毫升0.01%的氯金酸置于锥形瓶中，在磁力搅拌下加热至沸腾。移液器快速加入4毫升1%的柠檬酸三钠， 继续加热搅拌至溶液颜色变成酒红色稳定后，再加热 10分钟后停止加热，在磁力搅拌下冷却至室温，在520nm处测吸光度保持在0.8以上即可。所得的AuNPs 置于4℃冰箱中保存。

1.2.2 SELEX技术筛选适配体

(1)通过体外化学合成，建立一个单链寡核苷酸随机序列库，库容量一般是由1013～1018个独立序列组成，每条核酸链分为固定序列区和随机序列区。一般来说核酸的随机序列的长度在20～100个碱基，两端固定序列的长度为20~25个碱基。由于文库中包括大量具有随机序列的寡核苷酸，可以形成各种结构，理论上讲文库中的某些寡核苷酸可与靶物质(目标分子)相结合。库容量越大，获得能够与靶物质特异性结合的寡核苷酸的机率也就越高。

(2)在一定条件下，将这个库与靶物质在一定温度下(37℃)孵育一段时间，在最初几个循环中只有少数(0.1%～0.5%)的序列与靶物质作用，因此反应体系中有结合复合物与未结合序列，可用物理法如聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱法或硝酸纤维素滤膜法分离。

(3)把分离出来的寡核苷酸序列进行PCR扩增，变性成单链的次级文库，再与靶物质进行温育，进入下一轮的筛选，由此进入一个反复筛选富集的过程。随筛选轮数的增加，最后得到可与靶物质高亲合力和高特异性结合的的适配体。

(4)对最终得到的适配体进行克隆、测序和结构分析，从而获得高亲合力的寡聚核苷酸序列。

1.2.3 鱼体残留的检测

对一批身体状况良好且相似的鲤鱼在实验前24h停止投喂，减少胃肠内容物干扰。用软质胃管（直径1毫米）连接注射器，将药液缓慢注入鱼胃（灌胃体积≤1毫升/100克鱼体重）。分别在口灌后的2、4、6、8小时后解剖取鱼体内各个组织器官，加乙腈研磨离心后放入-20℃冷藏以待统一检测。最终确定肝脏为检测残留变化最有效部位。

2 结果与分析

2.1 核酸适配体的优良特性

(1)体外筛选、人工合成：核酸适配体是通过体外的SELEX技术筛选出来的，筛选出的适配体经测序后即可通过化学方法人工合成，具有极高的精确性、重复性和纯度。另外成本低，周期短，一般只需2～3个月，甚至在两三周内就能获得。而常规的免疫分析方法所需的抗体要依赖于细胞或是免疫动物才能获得，这就要受到免疫原性、机体耐受性等多种因素的限制，至少要3～6个月，且成本昂贵。

(2)分子量小、稳定性好:适配体是相对分子质量为（8～15）×10³的小分子，结构简单，与靶分子结合空间位阻小。适配体是一段核酸链，一般无免疫原性，不产生免疫反应，即使在高温、高盐浓度和络合剂等的作用下使其变性，在适当条件下也可恢复其活性，并可以长期保存常温下运输。经修饰的适配体稳定性可进一步提高，不易被环境中的核酶降解。将IgE特异性适配体应用于压电石英生物传感器，发现适配体能够耐受反复的亲和洗脱过程，且传感器的灵敏度几乎没有降低。

(3)高特异性和强亲和力：适配体可与靶物质通过某些碱基间的互补配对以及静电作用、氢键作用、疏水、堆积作用和范德华力等形成一些稳定的三维空间结构，如G-四分体、口袋(pocket)、发夹、茎环等。随筛选过程的进行，得到的适配体的解离常数(Kd)降低，从nmol/L到pmol/L，有的甚至到fmol/L，与抗体或其他类型配基相比可具有更高的亲和力和特异性。由于靶物质与适配体之间有较大的接触面积，靶分子结构上的细微差别可被适配体区分。适配体也能选择性地识别出光活异构体，例如一些适配体能将靶物质与其镜像体区别开。

(4)易于修饰：各种功能基团或报告分子能被准确地标记到适配体上的特定部位，且不会影响它的生物活性。而传统的抗原和抗体是蛋白质，难于修饰。目前在适配体的一端修饰巯基、生物素、氨基等用于固定，修饰一些电活性、光活性物质或是酶等作为信号标记都已经非常成熟。

(5)靶分子范围广：适配体的靶分子可以是较大的蛋白质分子，也可以是小分子物质，还可以是完整的病毒颗粒、细菌和细胞，甚至是新分离到的组织等。

2.2 可视化检测恩诺沙星的实验原理

AuNPs颗粒在溶液中呈分散状态，溶液颜色为酒红色，而加入NaCl以后，在带正电的NaCl的影响下，带负电的AuNPs会由于静电作用被诱导聚集，此时溶液显色为深蓝色。若加入适配体，适配体与AuNPs混合后吸附在纳米金颗粒表面，起到保护AuNPs的作用，使其在加入NaCl后不聚集，溶液仍显色为酒红色。由于适配体与AuNPs颗粒混合后，二者产生吸附作用相结合，适配体对于AuNPs有保护作用。此时加入目标物，若目标物中含有恩诺沙星，那么目标物中的恩诺沙星会和适配体产生特异性结合，使适配体与AuNPs颗粒表面解离吸附，此时AuNPs失去适配体的保护作用，在NaCl的条件下会发生聚集，颜色变为深蓝色。若样品中含有的恩诺沙星量少，那么适配体与AuNPs 颗粒表面解除吸附的就少，加入NaCl的条件下AuNPs 发生的聚集就少，颜色变化就不明显。恩诺沙星的存在多少将会导致溶液颜色变化的程度不同，溶液颜色将会随目标物中恩诺沙星含量的增加而由酒红色变为深蓝色，实现对恩诺沙星的可视化快速检测。

2.3 检测体系灵敏度

在浓度较低（检测限以下）时随着恩诺沙星浓度升高，抗体与胶体金标记抗原的竞争性结合增强，导致金颗粒聚集程度增加，溶液颜色逐渐由红色向深蓝色转变，520nm处吸光度值降低（红色胶体金颗粒在520nm有特征吸收峰，聚集后吸收峰红移，吸光度下降）。检测体系灵敏度可通过优化体系内关键组分（如NaCl浓度、适配体浓度）的比例实现调控。具体而言，通过调整各组分的摩尔比或浓度配比，可改变抗原抗体竞争性结合的平衡关系，进而影响胶体金颗粒的聚集程度及显色/吸光度信号的响应阈值，最终实现对检测灵敏度（如最低检测限LOD）的定向调节，下图为对体系灵敏度最低检测限探究。

视觉检测灵敏度时，在低浓度范围（0～5毫克/升）溶液呈明显红色（前3个样品），颜色无显著差异，表明此时恩诺沙星浓度较低，未竞争性抑制抗体与胶体金标记抗原的结合，金颗粒未发生有效聚集。在中浓度范围（7.5～15毫克/升）溶液颜色由红色逐渐过渡为紫色（第4～6个样品），肉眼可观察到明显颜色变化，提示金颗粒开始聚集，恩诺沙星浓度达到视觉可分辨的临界值。在高浓度范围（25～50毫克/升）溶液呈深蓝色（第7～8个样品），颜色深度趋于稳定，表明抗体结合位点已被完全竞争，聚集反应达到饱和。即肉眼判读的最低检测限（LOD）为15毫克/升，当恩诺沙星浓度≥15毫克/升时，溶液颜色由红色变为蓝色，可通过肉眼明确区分。

在吸光度检测灵敏度时，由下方吸光度曲线（520nm）可知在浓度0～15毫克/升吸光度值从0.55（0毫克/升）缓慢下降至0.48（15 毫克/升），下降幅度较小（约12.7%），表明低浓度下吸光度变化不显著，与肉眼观察到的“红色稳定期”一致。浓度15～25毫克/升吸光度从0.48（15毫克/升）快速下降至0.43（25毫克/升），下降幅度达10.4%，此阶段对应肉眼观察的“紫色转变期”，吸光度与浓度呈显著负相关（R²≈0.95），为线性响应区间。浓度＞25 毫克/升吸光度下降趋缓（25毫克/升时0.43，50毫克/升时0.41），曲线趋于平稳，表明抗体结合达到饱和，与肉眼观察的“深蓝色稳定期”一致。即仪器检测的最低检测限（LOD，按3倍信噪比计算）为12毫克/升，略低于肉眼判读灵敏度，符合胶体金法“仪器检测灵敏度高于肉眼判读”的普遍规律。

2.4 恩诺沙星检测高特异性

本研究选择氟甲喹、氟苯尼考、诺氟沙星、磺胺二甲氧嘧啶、左旋氧氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星考察方法的特异性。如图所示，在体系中加入500毫克/升的氟甲喹、氟苯尼考、诺氟沙星、磺胺二甲氧嘧啶、左旋氧氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星，除恩诺沙星外，加入其他抗菌类药物时在520nm处吸光度明显较高（大于0.5），与纯水对照大致相同，而加入恩诺沙星时吸光度明显较低（小于0.5）。从颜色反应来看，加入除恩诺沙星以外的抗菌药物可见体系颜色保持酒红色，近乎不改变。而加入恩诺沙星后，体系颜色由酒红色转变为深蓝色。其中依诺沙星相较于其他抗菌药物颜色变化较明显，由红色变化为淡紫色，是由于其与恩诺沙星均属于喹诺酮类药物，结构相似造成。但因药物用量较大，且与恩诺沙星颜色仍存在明显差异，故不对检测体系特异性造成影响。表明本方法对恩诺沙星具有特异性识别能力，且其他抗菌类药物不会影响恩诺沙星残留的特异性检测。

2.5 检测条件优化

为了提高检测的准确性和灵敏度。在恩诺沙星浓度为25毫克/升，对适配体浓度、NaCl浓度进行优化，讨论在不同条件下所测吸光度值的变化，并通过吸光度值变化来进行分析，寻求最佳的实验条件。

核酸适配体的浓度是决定检测灵敏度的关键因素。适配体浓度过低，无法对AuNPs形成有效保护，使检测体系的灵敏度降低。适配体浓度过高会造成试剂浪费同时也会影响检测的灵敏度。在胶体金溶液中加入0.1～5μmol/L的核酸适配体（胶体金：核酸适配体=30:1），观察溶液在520nm处吸光度变化。结果表明，当适配体浓度大于2.5μmol/L时，吸光度大小趋于稳定。因此选择适配体的浓度为2.5μmol/L。

NaCl溶液的浓度会影响胶体金粒子的分散性，关系整个检测体系灵敏度。实验观察0.1～1.0mol/L浓度的NaCl对AuNPs在520nm处吸收值的影响。可得在0.1～0.5mol/L范围内随着NaCl浓度的增加，溶液在520nm处吸光度逐渐降低，之后随着NaCl浓度增大，溶液在520nm处吸光度不再有明显变化。考虑到过高浓度的NaCl影响检测的准确性，故选择NaCl浓度为0.5mol/L。

2.6 快速检测试剂盒设计

A液：结合恩诺沙星核酸适配体的胶体金溶液5毫升
B液：NaCl溶液3毫升

萃取缓冲液：乙腈20毫升

使用方法：

1.取待检测鱼的肝脏组织，加入研磨管中，加入萃取缓冲液。

2.在显色柱中加入300微升A液，再加入100微升萃取缓冲液，等待一分钟。

3.加入B液25微升，等待30秒，观察颜色变化。

4.若溶液颜色由粉红色变为淡蓝或蓝紫色，则说明待测样品中有恩诺沙星残留。

3 结论

本文建立了一种快速有效的大宗淡水鱼恩诺沙星残留检测方法。这种方法应该具备操作简便、成本低廉、灵敏度高、准确性好等优点，能够满足现场快速检测的需求，从而及时发现并处理恩诺沙星残留超标的食品，降低食品安全风险，保障消费者的健康权益。