大口黑鲈（Micropterus salmoides）属鲈形目（Perciformes）、鲈亚目（Percoidei）、棘臀鱼科（Centrarchidae）、黑鲈属（Micropterus），别名加州鲈鱼、黑鲈是我国重要养殖品种之一。近年来，大口黑鲈养殖密度突增，加上水体富营养化、种质资源退化等原因，导致其病害逐渐增多。目前发现危害大口黑鲈的病毒主要有虹彩病毒（Ranavirus）和弹状病毒（Rhabdovirus）。

弹状病毒，水泡性病毒属，为线性负链单链RNA病毒。病毒粒子大小为53nm×140nm，形态似棒状或子弹状。弹状病毒病主要流行于春季（3～4月）和秋季（10～11月），水温在25℃ ～28℃时最容易发病。此外，该病也常在水温突然升高或降低时暴发。该病毒主要危害大口黑鲈的苗种，但也可感染成鱼。苗种阶段的鱼由于抵抗力较弱，往往更容易受到病毒的攻击。感染大口黑鲈鱼弹状病毒的鱼会表现出多种症状，包括但不限于：行为异常：病鱼在水中打转，反应迟钝，呼吸困难，常靠池塘边漫游；体表变化：病鱼体色变黑，体表出血，腹部肿大，鳍条可能溃烂；内脏病变：解剖病鱼可见肝脏严重肿大、充血，脾脏肿大，肾脏肿大，胃肠空虚无食。此外，鳔也可能严重出血。

中山地区主要养殖的大口黑鲈、鳜鱼（Siniperca chuatsi）等名特优水产品种产量居全国前列，均为弹状病毒的易感品种。近年来，广东省佛山市、中山市和江门市的大口黑鲈主要养殖场频繁暴发弹状病毒病，造成巨大的经济损失。虽然中山地区大口黑鲈养殖规模不断增大，但感染弹状病毒的流行病学仍缺乏全面系统的调查与分析。基于此，本研究对中山地区的大口黑鲈弹状病毒病进行完整周年的监测，以进一步了解该病毒的感染情况。本研究从2022年3月至2023年2月对中山地区养殖的大口黑鲈进行监测，从不同养殖时间和不同规格的宿主角度分析虹彩病毒阳性率变化，以期探明SRCV在大口黑鲈不同养殖阶段的流行规律，为SRCV的综合防治提供参考。

一、材料与方法

1.试验材料

（1）样品采集

样品采集时间为2022年3月至2023年2月，于中山疑似染病的大口黑鲈养殖场随机采集繁育阶段的大口黑鲈亲本、鱼苗、水样以及不同养殖阶段的鱼体，共采集1040份样品（每尾鱼的肝脏、脾脏和肾脏混合成1份样品，共1007份；繁育阶段每池水样为1份样品，共9份；每20尾鱼苗混为1份样品，共24份）。大口黑鲈样品均经无菌解剖后采集肝脏、脾脏和肾脏组织置于同一冻存管中，迅速放入液氮中冷冻后置于-80℃冰箱保存备用。

（2）主要试剂

大肠杆菌DH5α感受态细胞、DNA凝胶回收试剂盒购于北京全式金生物有限公司，FastPure® Plasmid Mini Kit，动物组织总RNA提取试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司，TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix购于北京全式金生物科技有限公司，2×M5 HiPerplus Taq HiFi PCR mix（with blue dye）购于北京聚合美生物科技有限公司，pMD-18T质粒、T4连接酶、DL2000 Marker、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）购于宝生物工程（大连）有限公司。

2.试验方法

（1）RNA提取与反转录

分别取样品约100mg，采用动物组织总RNA提取试剂盒提取组织总RNA，随后利用TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行反转录，合成cDNA模板。

（2）qPCR检测

参照SRCVTaqMan实时荧光定量（qPCR）检测方法，委托上海生工生物科技有限公司合成引物和探针（引物1:P1:5’-CGCGGATCCATCATGAAATCAATCATTGCACT-3’，P2:5’-CATCTGCAGAATTGATACTGCTGCAAAGGG-3’；引物2:HSHRV-2F:5’-CACCAGTCATATCAATCC-3’，HSHRV-2R:5’-CGGACTTAAACCTCATTC-3’；探针：HSHRV-2PFAM-ACCTCTCCGCACATTGACATCTBHQ1）。取cDNA模板进行qPCR检测，20μL反应体系为：2×PremixEx TaqTM 10μL，10μ mol/ L SRCVF与 SRCVR引物各0.4μL，10μmol/L SRCV探针 0.8μL，cDNA模板1.6μL，ddH2O 6.8μL。同时设重组质粒为阳性对照、ddH2O为阴性对照。使用 CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）进行扩增反应；反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃延伸30s，循环40次，在每个循环的60℃处采集FAM荧光信号。

（3）数据处理与分析

病毒检测阳性评判标准：Ct值≤35为阳性；Ct值＞35或显示为N/A，且没有特异性扩增曲线则判定为阴性。所有数据的图表绘制使用GraphPad 9.0和OriginPro。

二、结果与分析

1.不同养殖阶段大口黑鲈弹状病毒感染情况

qPCR检测结果显示，1040份样品的SRCV平均阳性率为14.42%，其中，73份繁育阶段样品的平均阳性率较低为4.12%，亲本和水样均检出SRCV，鱼苗阳性率为12.5%；养殖阶段样品的平均阳性率为15.20%，明显高于繁育阶段（见表1）。

2.不同养殖时间大口黑鲈弹状病毒感染情况

从季度角度分析，SRCV阳性率呈现先升后降的趋势（见图1），阳性样品主要在春季和夏季检出；其中，春季样品的阳性率最低为12.50%，最高为19.79%；而夏季样品的阳性率则最高达25%；秋季样品阳性率最低检出率降到1.33%，冬季未检出阳性样品，这可能与冬季样品量相对较少有一定关系。从月份角度分析，SRCV阳性率表现为3～8月份不断增长，但从12～2月份开始多个月份未检出阳性样品。月份流行趋势与季度流行趋势大体一致，为先升后降。进一步分析发现，不同养殖月份的SRCV阳性率存在一定差异，3月～5月，9月和10月的SRCV阳性率均<20.00%，但夏季样品的阳性率最高≥20%，最高为8月阳性率为25%；11月检出率最低仅为1.3%，在12月至次年2月均未检出阳性样品（见表1）。

图1 不同养殖季节加州鲈弹状病毒阳性率

3.不同规格大口黑鲈弹状病毒感染情况

从不同规格的大口黑鲈SRCV检测结果来看，小规格大口黑鲈的SRCV感染率最高平均阳性率为36.29%，中规格大口黑鲈的SRCV感染率次之（15.71%），大规格大口黑鲈的SRCV感染率最低（见图2）。

图2 不同规格加州鲈弹状病毒阳性率

三、讨论

本研究对珠三角地区大口黑鲈弹状病毒进行了周年监测，以明确感染弹状病毒的主要流行症状。患病大口黑鲈体表症状不明显，小规格鱼出现打转现象，解剖症状不明显；中规格鱼主要表现为肝脏、脾脏充血发红以及肠炎；大规格鱼则主要表现为脾脏和鱼鳔充血发红和肿大现象。本次调查结果显示，大口黑鲈弹状病毒的平均阳性率在14%左右，养殖阶段的平均阳性率（15.20%）显著高于繁育阶段的平均阳性率（4.12%）；该病毒病主要流行于夏季，夏季阳性率最高，冬季未检出阳性样品；该病毒最易感体长10cm以下的小规格大口黑鲈，而大规格大口黑鲈弹状病毒阳性率低于10%。